海马体中的新发现—位置细胞、NMDA 受体和长时程增强—使神经科学的前景更加令人振奋了。然而，对于空间地图和长时记忆两者之间的关系或者它们与外显记忆存储的关系，我们还一无所知。首先，虽然海马体中的长时程增强是一个迷人且普遍的现象，但它引起的突触强度的变化完全是人为的，这一人为的产物甚至让莫诺和布利斯怀疑“由于这一性质是通过同时的重复发放揭示的，无损动物在真实生活中是否会用到它……”。确实，看上去相同的放电模式不太可能发生在学习过程中。许多科学家怀疑长时程增强产生的突触强度的变化是否在空间记忆或空间地图的形成及保持方面起到作用。
我逐渐意识到探索上述关系的理想途径是通过遗传学，西摩·本泽就曾运用遗传学在果蝇中研究过学习。20世纪80年代，生物学家们开始将选择性繁育与 DNA 重组工具结合来培育基因修饰小鼠。这些技术使得操纵作为长时程增强基础的基因成为可能，因而能用以探讨一些我感兴趣并亟待解决的问题。长时程增强是否像海兔的长时程易化一样，具有不同阶段？这些阶段是否对应着空间记忆的短时和长时存储？如果答案是肯定的，我们就能够干扰长时程增强的其中一个或另一个阶段，由此来确定当动物在学习和记忆一个新环境时，其海马体的空间地图会发生什么改变。
重返对海马体的研究令我感到愉快，就像与旧爱再续前缘一样。我一直关注着相关研究进展，因此虽然时间过去了30年，但我对它还是比较了解的。在这方面，佩尔·安德森和罗杰·尼科尔都是我的好向导，但最能激励我的还是与奥尔登·斯宾塞一起在 NIH 做实验的回忆。我又一次感受到那种即将踏入一个新领域的兴奋劲—不过这一次配备的是威力和特异性十足的分子遗传学技术，这是奥尔登和我在我们最狂野的梦里也未曾想象过的。
这些分子遗传学进展的知识基础来自对小鼠的选择性繁育。进入20世纪以来的实验表明，各种品系小鼠之间的差异不仅在于它们的基因组成，还表现在它们的行为。有些品系在学习各种任务时表现得非常聪明，其他一些品系则特别愚蠢。观察到的这些现象表明基因对学习的影响。类似地，各种动物的恐惧感受、社交能力和养育能力也存在着很大差异。通过同系繁殖，行为遗传学家创造出了一些极易感到恐惧和不易感到恐惧的品系，从而突破了自然选择的随机性。因此，选择性繁育是分离出对特定行为负责的基因的第一步。现在的 DNA 重组技术不仅可以鉴别研究所需的特定基因，还能够检测这些基因在构成各种行为、情绪状态或学习能力基础的突触变化中起到的作用。
直到1980年，小鼠的分子遗传学依赖的还是一种称作正向遗传学的经典分析法，本泽在果蝇研究中用的就是这种技术。首先把小鼠暴露在一种化学物质中，这通常只会损伤小鼠基因组的1.5万个基因中的一个。不过这一损伤是随机发生的，所以哪个基因会受到影响谁都说不准。接着小鼠完成各种任务以观察其在哪种任务中（如果有的话）受到了那个随机突变基因的影响。由于小鼠必须被繁育若干代，正向遗传学非常费时费力，但它的突出优点是没有偏向性。这种方法不需要事先提出任何假设，因而在筛选基因时也就不存在偏向。
DNA 重组革命使得分子生物学家能够开发一种不那么费时费力的策略，即反向遗传学。在反向遗传学中，一个特定基因要么从小鼠基因组中移除，要么被导入基因组，然后检测它对突触变化和学习的影响。反向遗传学是有偏向的—它被用于检验某个特定的假设，比如一个特定基因及其编码的蛋白质是否参与了一个特定行为。
两种修饰个体基因的方法使得小鼠的反向遗传学成为可能。第一是转基因技术，将称作转基因的外源基因导入小鼠卵子的 DNA 中。卵子受精后，该转基因就成了子代小鼠基因组的一部分。然后再将成年的转基因小鼠进行繁育，以获得遗传学上的纯系小鼠，它们都会表达转基因。基因修饰小鼠的第二种方法是从小鼠基因组中“敲除”一个基因。它的实现手段是将遗传物质的一个片段插入小鼠的 DNA，导致被选中的基因失去功能，进而消除了小鼠体内由该基因编码的蛋白质。
我逐渐意识到，基因工程的这些技术，使得小鼠成为一种绝佳的实验动物，用于鉴别对各种形式的长时程增强负责的基因和蛋白质。然后我们可以把这些基因和蛋白质与空间记忆的存储关联起来。虽然小鼠是相对简单的哺乳动物，但它们的脑在解剖学构造上与人脑相似，和人类一样，它们的海马体也参与对位置和物体的记忆存储。此外，小鼠的繁殖速度比更大型的哺乳动物比如猫、狗、猴子和人类要快得多。这样一来，包含特定转基因或敲除基因的种群，就能够在数月内得到大量繁殖。
这些革命性的新实验技术在生物医学方面也有广泛应用。几乎人类基因组的每一个基因都存在若干不同版本，称作等位基因，分别存在于全体人类的不同成员中。人类神经和精神疾病的遗传学研究使得鉴别造成正常人群行为差异的等位基因和导致许多神经疾病的等位基因成为可能。这些疾病包括肌萎缩性脊髓侧索硬化症、早发性阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿氏病以及多种形式的癫痫等。通过把致病的等位基因插入小鼠基因组，研究它们如何对大脑和行为造成严重破坏，这一方法革新了神经病学。
最终促使我转向基因工程小鼠研究的，是我们实验室出现了几位天才的博士后研究员，其中包括赛斯·格兰特和马克·梅福特。格兰特和梅福特对小鼠遗传学的认识远胜过我，他们极大地影响了我们的研究方向。格兰特给了我研究基因修饰小鼠的初始驱动力，梅福特的批判性思维则在后期发挥了重要作用，帮助我们改进我们和其他人在第一代小鼠的行为研究中使用的方法。
我们最初使用的那种制造转基因小鼠的方法会影响小鼠体内的每一个细胞。我们需要找到一种方法将我们的基因操纵限定于脑部，特别是形成外显记忆神经环路的区域。梅福特开发了限制新移植的基因在大脑特定区域表达的方法。他还开发了控制脑中基因表达的时间点的方法，因而让基因的打开和关闭成为可能。这两项成就开启了我们研究的新阶段，并被其他研究者广泛采用。它们构成了当前对基因修饰小鼠进行行为分析的基石。
将长时程增强与空间记忆关联起来的首次尝试发生在20世纪80年代后期。爱丁堡大学的生理学家理查德·莫里斯发现，通过药理学方法阻断 NMDA 受体，可以阻断长时程增强并干扰空间记忆。此后，格兰特和我在哥大，利根川进和他的博士后研究员阿尔西诺·席尔瓦在麻省理工学院，通过各自独立进行的实验，将上述研究向前推进了重要一步。我们分别创造了一个不同的基因修饰小鼠品系，使其缺少一种被认为是参与到长时程增强的关键蛋白质。然后我们观察基因修饰小鼠与正常小鼠相比，其学习和记忆过程受到了怎样的影响。
我们测试小鼠在若干精心设置的空间任务中的表现。比如，我们把小鼠放在一个光照充足的大型白色圆形平台上，平台周围有40个洞。其中只有一个洞是逃生出口。平台在一个小房间里，房间的每一面墙上装饰着不同的区别性标记。小鼠不喜欢开阔的空间，特别是明亮的地方。它们会感到危险无助并试着逃跑。能够逃离平台的唯一方法是找到唯一的逃生出口。最终，小鼠通过学习那个洞和墙上标记之间的空间关系找到了它。
在尝试逃跑时，小鼠依次采用三种策略：随机法、序列法和空间法。每种策略都能让小鼠找到逃生出口，但其效率截然不同。小鼠首先随机地去试某个洞，很快它学到这一策略是没有效率的。接着，它从一个洞开始挨个尝试，直到找出正确的那个洞。这是一个更好的策略但仍然不是最好的。上述策略都不依赖空间—都不需要小鼠在脑中存储环境的空间结构的内部地图—而且都不需要海马体参与。最终，小鼠采用了确实需要海马体的空间策略。它学会去看哪面被标记的墙与目标洞匹配，然后以墙上的标记为向导，径直奔向那个洞。大部分小鼠会很快放弃前两个策略而学会采用空间策略。
接下来我们关注海马体中一个称作谢弗侧支通路的区域的长时程增强。加州大学圣迭戈分校的拉里·斯奎尔已经发现这一通路的损伤会造成类似布伦达·米尔纳的病人 H.M.经历的那种记忆缺陷。我们发现通过敲除一个特定基因—它编码对长时程增强很重要的一种蛋白质—能够破坏掉谢弗侧支通路中的突触增强。而且，这一基因缺陷与小鼠空间记忆的缺陷相关。
每年冷泉港实验室会举办一次针对生物学某个单一主题的会议。1992年的主题是“细胞表面”，由于大家认为利根川进和我们关于小鼠记忆基因的工作非常有趣，于是大会为我们新增了一段与细胞表面不相干的议程，让我们先后做了报告。利根川和我介绍了各自独立的实验，关于敲除一个基因如何抑制海马体一条通路中的长时程增强，同时还抑制了空间记忆。在那个时候，这是已知研究中长时程增强和空间记忆之间最直接的相关。此后不久，我们两个又都往前进了一步，考察长时程增强与在海马体中表征外部环境的空间地图如何关联。
到那次会议举行时，利根川和我都已经对彼此有了一点了解。在20世纪70年代，他已经发现了抗体多样性的遗传学基础，这对免疫学是一个非凡的贡献，他因此而获得了1987年诺贝尔生理学或医学奖。获得这项成就之后，他想要转向脑研究来征服一个新的科学天地。他是理查德·阿克塞尔的好朋友，理查德建议他找我谈谈。
当利根川1987年与我会面时，他最感兴趣的问题是意识。我则在试着激发他对脑研究的热情的同时也劝阻他研究意识，因为那时用分子取向来研究意识太困难，而且意识本身也缺乏合适的科学定义。既然他已经开始采用基因修饰小鼠研究免疫系统，因此转向学习和记忆对他而言既自然也很现实，当席尔瓦加入他的实验室时，他就开始了这方面的研究。
从1992年起，许多其他研究组也已经获得了与我们相似的结果，除了偶尔出现的重要例外情形，绝大多数实验都支持长时程增强的中断和空间记忆的损伤之间存在联系。于是，海马体成了开启考察长时程增强的分子机制以及这些分子在记忆存储中的角色的理想位置。
我知道小鼠的空间记忆，与之前研究过的海兔和果蝇的内隐记忆一样，包含两个部分：一个不需要蛋白质合成的短时记忆和一个需要蛋白质合成的长时记忆。现在我想找出外显短时和长时记忆的存储是否也有独特的突触和分子机制。海兔的短时记忆仅依赖于第二信使信号传导的短时突触变化，而长时记忆则需要基于基因表达改变的更持久的突触改变。
我和同事们检查了取自基因修饰小鼠的海马体切片，发现在海马体的三条主要通路中，长时程增强都包含两个阶段，类似于海兔的长时程易化。单次电刺激产生一个短暂的处于早期阶段的长时程增强，只持续一到三小时且不需要合成新蛋白质。神经元对这些刺激的反应就正如罗杰·尼科尔描述过的那样：突触后细胞中的 NMDA 受体被激活，导致钙离子流入突触后细胞。这里钙离子起到了第二信使的作用，它通过增强已有 AMPA 受体对谷氨酸的反应和刺激新生 AMPA 受体插入突触后细胞的细胞膜来触发长时程增强。为了对特定模式的刺激做出反应，突触后细胞还发回信号到突触前细胞，召唤更多的谷氨酸。
重复电刺激会产生一个处于后期阶段的长时程增强，其持续时间超过一天。我们发现这一阶段的性质与海兔中突触增强的长时程易化非常相似。在海兔和小鼠中，长时程增强的后期阶段都受到调节性中间神经元的强烈影响，调节性中间神经元在小鼠中被招募来把短时同突触变化转为长时异突触变化，它们还释放多巴胺，这是哺乳动物脑中一种常见的作用于注意和强化的神经递质。类似海兔中的血清素，多巴胺促进海马体中的受体去激活一种增加环腺苷酸数量的酶。不过，小鼠海马体中环腺苷酸的增加，其中很重要的一部分发生于突触后细胞，而在海兔中则是发生于突触前感觉神经元。这两种情况下，环腺苷酸招募蛋白激酶 A 和其他蛋白激酶，导致 CREB 的激活并打开效应子基因。
我们在海兔记忆研究中最惊人的发现之一是记忆抑制基因的存在，由它产生了 CREB-2蛋白。阻断海兔体内该基因的表达会增强与长时程易化有关的突触强度并增加其数量。在小鼠中，我们发现阻断该基因以及类似的记忆抑制基因会促进海马体中的长时程增强并强化空间记忆。
在这些研究中，我又一次与史蒂文·西格尔鲍姆进行了愉快的合作。我们对一个特定离子通道感兴趣，它抑制突触增强，特别是某些树突中的突触增强。奥尔登·斯宾塞和我在1959年研究过这些树突，并推断它们产生的动作电位会对从内嗅皮层到海马体的穿质通路中的活动做出反应。史蒂夫和我培育的小鼠缺失了作用于这一离子通道的基因。我们发现这些小鼠对穿质通路的刺激做出反应的长时程增强被加强了许多，这部分得益于树突产生的动作电位。这样一来，这些小鼠表现优异，它们比正常小鼠的空间记忆强得多！
我和同事们还发现，哺乳动物的外显记忆和海兔或果蝇的内隐记忆不同，前者除了 CREB 外还需要若干基因调控蛋白。尽管证据还不完整，但看上去在小鼠中，基因的表达也引起了解剖学变化—特别是新突触连接的生长。
尽管内隐记忆与外显记忆之间存在显著的行为学差异，但无脊椎动物内隐记忆存储的一些机制在数百万年的进化中一直是保守的，脊椎动物的外显记忆存储用的也是这些机制。虽然伟大的神经生理学家约翰·埃克尔斯在我科研生涯的早期曾叮嘱我不要为了研究黏糊无脑的海生蜗牛而放弃前途光明的哺乳动物脑的研究，但现在我们很清楚的一点是，记忆的一些关键分子机制是所有动物共享的。