洪堡的回信并不是泛泛的恭维。他仔细地评论了达尔文的观察：引用准确的页码，列出证据，并讨论具体的论点。洪堡认真阅读了每一页。他还致信英国地理学会——这封信被发表在学会杂志，供会员阅读——称赞达尔文的书：“在我漫长一生有幸见证其发表的作品里，这是最出色的一部。”达尔文喜出望外。“再没有什么能比这更让我高兴的了，”他说，“年轻的作者没办法一口吞下这么多赞许。”他给洪堡回信，感谢他给予自己公开的称赞，称这是莫大的荣誉。后来，在洪堡的策划下，《乘小猎犬号环球旅行》被翻译成德文。达尔文在给友人的信件中写道：“我现在必须向您进行一番无可救药的自夸了！”
达尔文风风火火地投入工作。他同时开展多个领域的研究：从珊瑚礁、火山到蚯蚓。“我舍不得离开自己的工作，哪怕半天也不行，”他对亨斯洛说。过度的劳累让他频繁地心慌气短，特别是遇到让自己特别兴奋的事情时。其中特别激动人心的是从加拉帕戈斯群岛带回的鸟类标本：当达尔文仔细分析这些发现时，他开始思考物种演化（evolve）的可能性——即当时很多学者所说的“物种之演变（transmutation）”。
加拉帕戈斯群岛上的达尔文雀
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与达尔文最初想象的不同，他们在各个岛上收集到的雀类和嘲鸫并不是陆地上常见鸟类的变种。“小猎犬”号返回英国后，英国鸟类学家约翰·古尔德（John Gould）对带回的鸟类标本进行了仔细的鉴定，宣布这些鸟类都是不同的物种。达尔文继而发现，每个岛屿都有自己当地的特有种。这些岛屿都起源于较近期的火山爆发，因此只有两种可能的解释：一是上帝特地为加拉帕戈斯群岛创造了这些独特的物种；二是这些特有种都演化自同一种迁徙到群岛地区的鸟类，因为地理隔离而变成了不同的种。
这一设想意义深远。如果最初是上帝创造了动物和植物，那么物种的继续演化是否意味着上帝一开始就犯了错？类似地，如果有些物种灭绝了，而上帝不断地继续创造新的物种，那是否表明他在不断地改变自己的主意？对很多学者而言，这一可能性令人战栗。物种发生演变的可能性早已在各种讨论中被提及。达尔文的祖父伊拉斯谟就在自己的著作《生物学》中提过这一想法，而洪堡在巴黎植物园的老朋友让-巴蒂斯特·拉马克也提出过类似的观点。
早在 19 世纪的最初十年间，拉马克就提出：生物会受到环境的影响，并可能就此沿着一条不断优化的轨迹变化。1830 年，就在达尔文出海之前，关于物种是固定不变的还是可能发生演变（transmutation）的辩论已经在巴黎科学院升级为公开的激烈争论。⑦洪堡从柏林赶去，参与了这一场辩论，当场就向邻座学者小声抱怨和批评物种固定论一方的观点——早在 20 多年前，洪堡就在《自然之观点》中提到过“物种的逐渐转化（transformation）”。
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达尔文也确信，认为物种静止不变是一种错误的观点。一切事物都变动不居，或者如洪堡所说的：如果连大地都在变形，山和海都在移动，温度在长时间内会降低或升高——那么一切生物“必定也在经历类似的变化”。如果环境确实对生物的发育产生了影响，那么科学家们必须更仔细地研究气候和环境。因此，达尔文开始关注整个地球的生物分布情况，而这正是洪堡所擅长的——至少就植物研究而言。达尔文说：“植物地理学是研究生命创生规律的关键。”
在研究来自不同大陆和生长在不同气候条件下的植物种类时，洪堡提出了植被带（vegetation zone）的概念。他发现，相似的环境通常含有近缘的物种，虽然它们相互之间可能远隔重洋或层层山脉。但这同时令人困惑，因为虽然跨大陆的相似性确实存在，但相似的环境并不总是，也不一定会产生相似的植物或动物。
在阅读《旅行故事》时，达尔文圈出了不少类似的例子。⑧洪堡曾提问：为何印度的鸟类不如南美洲的鲜艳多彩？为何老虎只存在于亚洲？为何奥里诺科河下游有如此多的巨鳄，但上游却全然没有？达尔文被这些例子深深吸引，经常在页边加上自己的注解：“就像巴塔哥尼亚的情况一样”“在巴拉圭也是这样”“类似的还有美洲原驼”；有时候只有一句简单的“正是如此”或一个“！”。
查尔斯·莱尔等人认为，相隔遥远却彼此相似的植物是在不同的地点独立起源的。上帝接连创造了这些相似的物种，将它们放在不同的区域，构成一系列“多重创造”。达尔文不同意这种观点，并开始为自己的见解收集物种迁徙和分布的证据。洪堡的《旅行故事》成了他的参考资料之一。他圈点、评论并为洪堡的著作制作索引，还在书的末页粘上字条，在上面写下提醒自己的“等开始研究加那利群岛上的植物地理分布时，重读这一段”，或在笔记本上反复地记下“研究洪堡的看法”或“参考《旅行故事》第六卷”。当发现第六卷并没有包含更多例子时，他会补上“没有关于物种理论的资料”。
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物种的迁徙成为达尔文演化思想的主要支柱之一。相互关联的物种如何在全球范围内迁移？为了回答这一问题，达尔文进行了不少试验，例如检测植物种子在咸水中的生存能力，以此来判断植物是否可能漂洋过海。洪堡提到，特内里费岛的泰德峰上生长着一种橡树，其形态与西藏地区的一种相似。达尔文问道，“橡树的果实是如何传播的……鸽子将谷物带到诺福克郡，将玉米带到北极圈”。当读到洪堡对啮齿动物如何打开坚硬的巴西果，以及猴子、鹦鹉、松鼠和金刚鹦鹉如何争夺作为食物的种子的记述时，达尔文在页边写道：“于是就这样播散开了。”
洪堡倾向于相信，植物的迁移谜题是无法解开的，但达尔文决定迎难而上。洪堡在《旅行故事》中写道，研究动植物地理学并不是为了“探寻事物的起源问题”。达尔文在这句话下重重地画了一条线。至于他为何这样做、当时在想些什么，我们大概永远无法得知，但可以明确的是，达尔文后来恰恰这样做了：他想去探寻物种的起源。
达尔文开始思考关于共同祖先的问题，洪堡也为这一领域提供了丰富的例证。奥里诺科河的巨鳄相当于放大版的欧洲蜥蜴，而如果放大常见的家养小猫，那么它们和老虎、美洲豹也相差无几。但物种为何会发生变化？是什么触发了它们的可变性（mutability）？法国科学家拉马克（也是物种演变论的主要支持者之一）认为，是环境的变化使某些物种的前肢变成了翅膀。但达尔文认为这一观点是“纯然无用的废话”。
达尔文的答案在一种名为“自然选择”的机制中。1838 年秋，他读到一本进一步形塑了自己想法的书：英国经济学家托马斯·马尔萨斯（Thomas Malthus）的《人口学原理》（Essay on the Principle of Population）。马尔萨斯在书中悲观地预测，地球人口的增长速度将超过粮食供应的增长速度，除非有类似于战争、饥荒和流行病这样的“限制因素”将人口总数控制在一定范围内。马尔萨斯认为，物种存续的关键在于超量繁殖后代。洪堡在《旅行故事》中也提到过，乌龟一次会产下很多蛋，从而保证至少有一些能存活下来。自然中有大量的种子、鱼卵以及鸟蛋，但只有极少数能够萌发、孵化，乃至活到成年。毫无疑问，是马尔萨斯为达尔文提供了他设想“推动演化之机制的灵感”。不过，早在阅读洪堡的著作时，达尔文就已经构思出了“自然选择”的雏形。
洪堡谈到了动植物如何“限制彼此的数量”，以及为了争夺空间和养分而“进行漫长、持久的竞争”。这是一场残酷无情的战斗。他注意到，丛林中的动物“相互畏惧”，“很少在力量型的生物身上发现善意”。这一思想将成为达尔文自然选择理论中的核心组成部分。