与此同时，洪堡的事业一帆风顺，关注的问题也愈发广泛。他开始关注矿工的工作条件。他为这些每天早晨爬进矿道、深入地下的工人发明了一种呼吸面罩，以及能在矿井的低氧环境下工作的提灯。他惊讶于工人们缺乏科学常识的现状，于是为他们编写教材，并创立了一所矿工学校。他翻阅历史文献，发现当中经常提到丰富的矿藏和古老的发现，意识到这可能对开发和利用废弃矿山有价值，于是连日埋头解读 16 世纪的手稿。一些同事看到他惊人的工作与旅行节奏，都说此人一定长了“八腿四臂”。
所有这些高强度的事务最终把洪堡累得病倒了。他经常发烧，并饱受神经紊乱之苦。他推测这无非是因为长期劳累，以及在寒冷的矿井下停留太久的缘故。但即使在这样的身体条件下，洪堡仍然发表了他的第一批著作：一篇关于莱茵河两岸玄武岩分布的专业论文，还有一篇描述弗莱贝格地下生物的论文——奇特的霉菌和海绵状的植物，它们生长在矿井中潮湿的梁柱表面，呈现出精巧的形状。他将精力集中在自己能够测量与观察的事物上。
18 世纪的“自然哲学”——我们今天称之为“自然科学”——是一门探讨形而上学、逻辑学、道德哲学的学问，之后，它逐渐演变为拥有特殊的技术手段与方法论的独立学科。随着该学科的发展，新的自然哲学问题继续涌现，逐渐发展出植物学、动物学、地质学和化学等各异的子学科。虽然洪堡同时在若干个领域中工作，他仍将这些课题按学科区分开来。这种专业化的趋势让人的视野变得狭窄，容易注重细枝末节而忽略整体，而“整体”将在未来成为洪堡独特的贡献。
洪堡用蛙腿进行的“动物电”实验
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这段时期，洪堡开始执着地研究所谓的“动物电”——又称伽伐尼电流，以发现这一现象的意大利科学家路易吉·伽伐尼（Luigi Galvani）的姓命名。伽伐尼发现，用不同的金属接触裸露的动物肌肉时，肌肉会自动收缩,神经纤维会剧烈抽搐。他猜想动物神经中含有电。这一可能性让洪堡着迷，他总共用青蛙、蜥蜴和小鼠进行了 4 000 多次实验：切开动物的身体，然后触碰、戳动和电击。但他不满足于动物实验，甚至开始利用自己的身体。在去往普鲁士各地的旅程中，他会随身携带实验器材。晚间，等公事结束以后，他就在租住的狭小卧室中架上电路器材，将金属棒、钳子、玻璃板、盛着不同化学试剂的瓶子和纸笔一起摆满桌面。他用一把手术刀在自己的手臂和躯干上划出小口，然后小心地将药剂和酸液滴在伤口上，用金属、电线和电极碰触皮肤表层或舌下，仔细地记录每一次痉挛、抽搐、烧灼或疼痛的感觉。有些伤口开始感染，皮肤上出现长长的血痕。他承认，自己的身体伤痕累累，像个“沿街乞讨的流浪儿”，但同时坚定地宣称，虽然饱受剧痛，但实验进行得“非常完美”。
通过这些实验，洪堡参与了当时科学界最为热烈的讨论之一：有机与无机物质的概念，以及两者当中是否蕴含着某种“力”或者“活跃的要素”。牛顿认为，从根本上来说，所有物质都是惰性的，是上帝给予了它们其他附加的性质。与此同时，另外一些科学家则忙于改进植物与动物的分类学，并不那么关心动植物与非生命体是否被两套截然不同的定律支配，他们更希望让混沌多样的现象变得井然有序。
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18 世纪晚期，一些科学家开始质疑视自然为机械模型的观点，认为这不足以解释生命物质的存在。当洪堡进行“动物电”实验时，已经有更多的科学家相信，物质不是僵死的，必然存在一种激发其生命活动的力量。欧洲各地的科学家们逐渐抛弃了笛卡尔的主张，即认为动物本质上是机器。法国的医生们、苏格兰的外科医生约翰·亨特（John Hunter），以及洪堡在哥廷根的老师约翰·弗里德里希·布卢门巴赫（Johann Friedrich Blumenbach），都开始提出自己关于生命本质的新理论。洪堡在哥廷根时，布卢门巴赫将他的著作《论形成力》（Über den Bildungstrieb）修订再版。布卢门巴赫在该书中提出，动植物体内蕴藏着若干种力量，其中最重要的一种是“形成力”（Bildungstrieb），即塑造生命形式的力量。他认为，从人类到霉菌，每一种生物都具有这种“形成力”，它是生命起源所不可或缺的。
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对洪堡而言，每进行一次实验，就意味着又向解开“生命过程的戈耳狄俄斯之结”①的目标迈近了一步。
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① Gordian Knot，比喻棘手的难题。