深入雨林，穿越亚诺斯平原，洪堡和邦普兰结束了为期六个月的艰险之旅，满身疲惫地于 1800 年 8 月底返回库马纳。然而他们很快便重新振作起来，整理完收集来的标本，再次踏上征途。11 月底，他们启航向北，于 12 月中旬到达古巴。1801 年初，在哈瓦那的一个早晨，洪堡翻开报纸读到了一篇报道，立即改变了继续前往墨西哥的计划。报道称，尼古拉·博丹船长，也就是三年前洪堡曾经试图联系的那位探险家，终于得以开始进行环球航行。1798 年，法国政府无法资助博丹的船队，也使洪堡没能如愿离开欧洲；但现在，博丹已经得到了足够的经费，装备了两艘船只（分别名为“地理学家”号与“博物学家”号），此刻正在前往南美洲的途中，并打算从那里进入南太平洋，然后再到澳大利亚去。
洪堡猜想，博丹最有可能取道利马。如果一切顺利，“地理学家”号与“博物学家”号大约会在 1801 年底到达那里。虽然时间紧迫，但洪堡决定赶往秘鲁去与博丹碰头，然后加入他的船队前往澳大利亚，而非墨西哥。事已至此，洪堡没有办法提前通知博丹约好见面的时间和地点，也没办法确定船长是否真的会途经利马，甚至不知道船上是否还能再容纳两名随行的科学家。但面前的困难越多，他就越“急切地想要解决它们”。
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拖着笨重的行李进行环球旅行显然不现实。安全起见，洪堡和邦普兰开始紧张地抄录他们的笔记和手稿，把此前一年半内囤积的物品分类、装箱、寄回欧洲。洪堡给柏林的一位友人写信，说自己“并不确定，甚至感到不太可能”与邦普兰能够活着完成环球旅行。所以他们需要确保至少有一部分宝藏能够完好地回到欧洲。洪堡带在身边的只有一个小型植物园——夹有压平标本的一本书，以便与后面新发现的物种相比较。更完整的一套植物标本被留在哈瓦那，静候他们归来。
欧洲战火未息，海上航行仍然充满危险，洪堡担心他珍贵的标本会被敌船截获。为了分散风险，邦普兰建议将物品分为两份：一份运往法国；另一份则经由英国运往德国，并附上说明：如果货物被敌船截住，就将其转交给伦敦的约瑟夫·班克斯。自从 30 年前随同库克船长的“奋进”号航行归来后，班克斯逐步建立了遍及全球的植物收藏渠道，来自各国的船长都知道他的名字。班克斯还长期致力于帮助法国科学家获得前往国外的护照——尽管英法两国在拿破仑战争中相互为敌，但他相信科学家的国际社群应该超越战时的国家利益。班克斯曾经说过：“两个国家的科学可以和平共处，尽管它们在政治上剑拔弩张。”把标本交给这个人最安全。①
洪堡致信家中亲友，向他们保证自己比以往更加开心和健康。他详细地描述冒险的细节，从美洲豹与蟒蛇的威胁讲到壮美的热带景观和奇丽的花朵。在给一位亲密友人的妻子的信中，他忍不住以这样的问题收尾：“那么您呢，最亲爱的人，您那单调的生活最近如何？”
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信件甫一寄出，收藏品也顺利离港，洪堡和邦普兰于 1801 年 3 月中旬从古巴出发，并于两周后，也就是 3 月 30 日，抵达新格拉纳达总督辖区②北部沿海城市卡塔赫纳（位于今天的哥伦比亚境内）。洪堡再次决定绕道而行：他不但要赶在 12 月底之前到达利马与博丹的船队碰面，还要舍弃相对容易的海路而改走陆路。途中，洪堡和邦普兰将穿越、攀登并考察安第斯山脉——它包含若干道山脊，从北向南纵贯南美洲大陆，北至委内瑞拉和哥伦比亚，南抵火地群岛，长达 4 500 多英里，是世界上最长的山脉。洪堡想攀登钦博拉索山。这座美丽的雪顶火山位于今日厄瓜多尔的首府基多以南，高近 21 000 英尺。在当时，它被认为是世界上最高的山峰。
从卡塔赫纳到利马的 2 500 英里将是极为艰苦的路程。他们将穿越难以想象的险恶地势，挑战自己的生理极限。但穿越这片从未有科学家踏足的区域，又是莫大的诱惑。洪堡后来说，“当人年轻又有活力的时候”，不太会多想行动所涉及的不确定性和危险。如果想要在利马与博丹碰面，他们只有不到九个月的时间了。首先需要从卡塔赫纳出发，沿马格达莱纳河到达今天哥伦比亚的首都波哥大。从那里，他们将穿越安第斯山脉去往基多，然后再一直向南行进，直到利马。洪堡告诉自己：“一切困难都能用强大的力量征服。”
在向南行进的途中，洪堡还想去波哥大拜访著名的西班牙植物学家何塞·塞莱斯蒂诺·穆蒂斯（José Celestino Mutis）。4 年前，66 岁的穆蒂斯从西班牙来到这里，已经领头进行了多次对当地的探险考察，世界上恐怕没有比他更熟悉南美洲植物的人了。洪堡希望将自己所获的标本和穆蒂斯穷其一生之力所积累起来的收藏进行比较。虽然传言穆蒂斯性情古怪、戒备心强，但洪堡仍希望能争取到他的帮助。“穆蒂斯，我离你已经这样近！”洪堡在到达卡塔赫纳时想道。他从这里给这位年老的植物学家寄去了一封“非常做作的信”，信里写满了称赞和恭维。他还在信里宣称，自己之所以不走海路，而选择更艰难的陆路去往利马，唯一的目的就是能够经过波哥大，与穆蒂斯见面。
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4 月 6 日，洪堡等人离开卡塔赫纳去往马格达莱纳河，他们需要向东跋涉 60 英里。点点萤火照亮了途经的密林，洪堡称它们为黑暗中的“路标”。若干个夜晚，他们一行人不得不和衣睡在硬邦邦的地上。两个星期后，他们将独木舟推入马格达莱纳河，乘舟向南，朝波哥大行进。在此后将近两个月的行程中，他们都要驾船溯游而上。一路上水流湍急，沿岸蜿蜒着茂密的林带。当时正逢雨季，鳄鱼出没，蚊虫扰人，天气湿热得难以忍受。6 月 15 日，他们到达了河港小城翁达。此地大约有 4 000 名居民，位于波哥大西北方向不到 100 英里处。他们从这里弃舟登陆，沿河谷山坡陡峭的小径往上爬——波哥大就坐落在海拔 9 000 多英尺的一片高原上。邦普兰被稀薄的空气折磨得非常痛苦，感到阵阵恶心，好像发烧一样。虽然路途艰辛，但他们二人终于在 1801 年 7 月 8 日抵达波哥大，等待他们的是英雄凯旋般的荣耀。
穆蒂斯与其他当地名流带头迎接，随之而来的是一场接一场的盛宴。波哥大已经有数十年没有举行过如此隆重的欢庆活动。对于繁文缛节，洪堡向来毫无兴趣，但穆蒂斯劝他别表现出来，因为总督和其他的重要人物都在场。等到应酬结束后，年迈的植物学家终于打开了他的橱柜。穆蒂斯还拥有一间画室，包括一些印第安人在内的 32 名画家总共绘制了 6 000 多幅当地植物的水彩画。洪堡后来向威廉描述道，穆蒂斯的收藏规模仅次于班克斯在伦敦的私人图书馆。这对洪堡而言是绝好的机会：离开欧洲两年，他终于能够再次随心所欲地翻阅书籍、查询资料，并将自己的观察与书中的记载进行比较与对勘。同样，穆蒂斯也大有收获：一位欧洲科学家历尽艰险远道而来，只为了与他见上一面，这真是莫大的恭维，也让他在本地人面前有了更多光彩。
正当二人准备离开波哥大的时候，邦普兰热病复发，再次病倒，几个星期后才痊愈。翻越安第斯山脉到利马的时间愈发紧张。9 月 8 日，也就是到达波哥大整整两个月之后，他们终于与穆蒂斯作别，而后者赠予了大量的食物补给，多到用三匹骡子都差点运不过来。其余的行李需要另外八头骡子与牛来驮运，但最精密的仪器则交给五位挑夫、当地的背工③，以及从最初到库马纳时便一直跟随着他们的仆人何塞。他们为穿越安第斯山脉做好了一切准备，但天气实在不能更糟。
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离开波哥大之后，他们必须经过金迪奥隘口才能翻越第一道山链——这个隘口海拔将近 12 000 英尺，被公认为是安第斯山脉中最危险、难度最高的山道。洪堡一行顶着惊雷、暴雨和飞雪在泥泞的路上前行，有些地段仅有八英寸宽。洪堡在日记中写道：“在安第斯山中，我们必须将自己全部的手稿、仪器和藏品交托给这些险境。”他惊讶地目睹骡子们如何巧妙地保持平衡，虽然前进的步态“跌跌撞撞”，并非一直都在很平稳地行进。途中还打碎了一些玻璃罐，这也意味着从马格达莱纳河收集来的鱼类和爬行动物标本已全军覆没。几天之内，他们的鞋底就被泥土中钻出的笋芽撕裂，所有人不得不赤脚继续前行。
与背负重荷的骡子一起穿越安第斯山
翻山越岭，他们缓慢向南，朝基多而去。地势忽高忽低，他们时而遭遇暴雪，时而下降至高温炎炎的热带森林。有时峡底的小道十分深幽、不见天日，必须摸索着岩壁才能探到路；有时走出山谷，豁然开朗，穿行在遍洒阳光的草原上。某些早晨，他们能见到白雪覆盖的山峰在纯蓝的天穹下闪耀；另一些时候则云雾弥漫，伸手不见五指。巨大的安第斯神鹫张开宽达三米的双翼，在高空中孤独盘旋——它们全身乌黑，只露出颈边一圈项链般的白羽与翅膀末端流苏般的白边，在正午的太阳下“像镜子一样闪亮”。行程近半时的某个晚上，在深黯的夜空下，他们远远地望见帕斯托火山口喷发出明亮的火舌。